本研究利用16S rRNA測序分析對塑料圈微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能進行了探究。

自然海洋環(huán)境中塑料圈微生物群落的結(jié)構(gòu)和組裝機制

The structure and assembly mechanisms of plastisphere microbial community in natural marine environment

作者：Sheng-Jie Zhanga , Yan-Hua Zeng a , Jian-Ming Zhu a , Zhong-Hua Cai a,b, Jin Zhou a,b*

期刊：Journal of Hazardous Materials

時間：2021.7.30

影響因子：10.588

一、文章摘要

最近，海洋環(huán)境中微塑料(MPs)上的微生物定植特征引起了全球的興趣。然而，許多研究只是描述了塑料圈微生物群落特征，卻沒有考慮微生物群落組裝背后的生態(tài)過程。在此，作者在1周、4周和8周進行了三時間點暴露實驗，并研究了天然沿海水體中聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯5種MP顆粒的定植動力學(xué)。通過16S rRNA高通量測序，作者發(fā)現(xiàn)塑料圈微生物群落的多樣性和均勻性高于海水微生物群落(p < 0.05)，并且微生物定植受環(huán)境因素、聚合物類型和暴露時間的共同影響。潛在功能和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，MP暴露增強了外源生物降解潛力，降低了MP微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。同時，零模型分析表明，隨機過程比確定性過程在塑料圈微生物群落結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮了更大的作用，擴散限制在更大程度上決定了微生物的演替軌跡。該研究加強了大家對塑料相關(guān)微生物在定植過程中控制微生物群落模式的生態(tài)機制的理解。

二、主要內(nèi)容

1.MP暴露期間的環(huán)境參數(shù)

在實驗中評估的物理參數(shù)中，從第1周到第8周，溫度和濁度變化顯著(p < 0.05)。相比之下，鹽度和pH值無顯著差異。在化學(xué)參數(shù)中，總有機碳(TOC)在0.808 ~ 2.258 mg/L范圍內(nèi)變化，第4周達(dá)到峰值，同時DO濃度達(dá)到最大值(6.84 mg/L)。此外，氮源物質(zhì)(NO3、NO2和NH4+)濃度在0.0025 ~ 0.072 mg/L之間波動。

2. 不同MP基質(zhì)上細(xì)菌多樣性的時間分布

經(jīng)過組裝和質(zhì)量過濾，75個樣本共9441864條高質(zhì)量序列聚類成208646個OTUs。利用α-多樣性估計細(xì)菌群落復(fù)雜度，包括豐富度（Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）。在1-8周內(nèi)，除貝殼外的所有基質(zhì)的細(xì)菌豐富度和多樣性均有增加(p<0.05)。在第1周，與浮游細(xì)菌群落相比，除PVC外，MPs上的細(xì)菌豐富度和多樣性均無顯著差異。但隨著暴露時間的延長，在第8周，MP顆粒的豐富度顯著高于海水細(xì)菌(p < 0.05)。同樣，PP和ABS也有較高的多樣性。在聚合物類型方面，第1周，PVC的多樣性較低，而在第8周，PS的豐富度和多樣性最低。綜上所述，塑料圈群落多樣性受暴露時間和聚合物類型的影響。

圖1 海水樣品和生物膜樣品中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)（A）和Shannon指數(shù)（B）

3.塑料圈微生物群落與環(huán)境因子的聚類分析及相關(guān)性研究

采用基于Bray-Curtis差異矩陣的NMDS方法，識別海水與塑料圈微生物群落的分離模式。三個時間點之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的分離。海水、自然基質(zhì)(木材和貝殼)和MPs之間的微生物類群在8周暴露期間具有不同的聚類分布，此外，五種類型的聚合物上的微生物聚類分布隨時間變化而變化。在初始階段（1周），塑料圈群落緊密聚集。中期（4周），MP相關(guān)菌群的置信橢圓顯著偏離了水體和自然基質(zhì)中的相關(guān)菌群的置信橢圓(p < 0.05)。進入最后階段（8周），PE、PP、PS、ABS上的細(xì)菌群落置信橢圓幾乎完全重疊，說明這些材料上的細(xì)菌群落具有相似性。為了闡明環(huán)境因素對MP相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，作者進行了RDA分析，發(fā)現(xiàn)MPs上的細(xì)菌群落多樣性與鹽度、水流、pH、濁度、PO43-、NO3-呈正相關(guān)，與溫度呈負(fù)相關(guān)。此外，利用VPA分析評價環(huán)境參數(shù)對細(xì)菌分布的影響。在OTU數(shù)據(jù)中觀察到的微生物群落變化中，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)物、物理和化學(xué)因素分別占14.3%、8.7%和4.6%。約有62.9%的微生物種類變化不能用這些條件參數(shù)解釋，說明其他因素也影響了塑料圈群落。

圖2 不同時間點不同樣品間細(xì)菌群落多樣性的比較

4.不同暴露時間和基質(zhì)類型情況下塑料圈微生物群落的分類組成

利用16S rRNA基因分析不同聚合物類型經(jīng)過不同暴露時間后細(xì)菌定植的動力學(xué)過程。浮游細(xì)菌群落主要為變形菌、藍(lán)藻菌、擬桿菌、浮霉菌和厚壁菌。第1周，所有樣品中，γ-變形菌和α-變形菌都是優(yōu)勢菌群，1周后，海水樣品中γ-變形菌的相對豐度顯著低于MP樣品。第4周生物膜樣品上擬桿菌(Bacteroidetes)的豐度顯著增加，第8周生物膜樣品上浮霉菌 (Planctomycetacia)的豐度顯著增加(p <0.05),表明相比生活在海水中，這些細(xì)菌更容易附著在顆粒上。另外，不同的聚合物類型之間也觀察到顯著的差異，每種類型都有一個特定的代表物種?？扑缴希诔跏急┞?1周)后，弧菌科、藍(lán)藻科、紅桿菌科和生絲單胞菌科(尤其是在PVC中)是5種MPs中相對豐度方面最具代表性的類群。進入第4周，，塑料和木材上黃桿菌的數(shù)量均高于貝殼。Family_XII 和Marinifilaceae 在貝殼上的分布均高于塑料。經(jīng)過8周的暴露，Pirellulaceae和Cryomorphaceae 在塑料上富集，而黃桿菌科和Family_XII 在木材和貝殼上的比例分別顯著增加(2-3倍)。通過LEfSe分析識別不同MP樣本之間的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌群落的生物標(biāo)記物保持不變，還有一些樣品的生物標(biāo)志物隨暴露時間的延長而變化。這些結(jié)果表明，標(biāo)記菌屬在不同微塑料類型上的定植具有底物優(yōu)先性。

圖3 不同樣品在綱(A)和科(B)水平上的相對豐度

5.塑料圈微生物群落的網(wǎng)絡(luò)分析

為了解細(xì)菌群落中類群之間的潛在相互作用，作者通過計算成對的Spearman相關(guān)系數(shù)（ρ>0.8），對顯著的類群進行了共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析。發(fā)現(xiàn)海水微生物群落的相關(guān)OTUs數(shù)量最高，其次是MPs和貝殼生物膜，木材生物膜的相關(guān)OTUs數(shù)量最低。這說明MP細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)比海水浮游細(xì)菌更簡單。根據(jù)Newman（2006）的觀點，如果模塊化指數(shù)>為0.4，則網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu)，可以分為幾個獨立的組。在本研究中，海水、MPs相關(guān)生物膜、木材/貝殼模塊化指數(shù)分別為0.981、0.459–0.992、0.647–2.847，表明形成的網(wǎng)絡(luò)具有模塊化輪廓。此外，高度連接的節(jié)點代表的是在保護微生物群落的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著作用的關(guān)鍵物種。利用這一標(biāo)準(zhǔn)，每個網(wǎng)絡(luò)中有10個OTUs被識別為關(guān)鍵種屬。塑料圈細(xì)菌群落的關(guān)鍵屬包括更廣泛的門，如變形菌門、擬桿菌門等。此外，微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種也表現(xiàn)出一定的基質(zhì)偏好。

圖4 海水、微塑料生物膜、木材生物膜和貝殼生物膜等微生物群落的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析

6.與MPs相關(guān)的微生物的潛在功能

為了研究底物類型對生物膜群落中微生物功能多樣性的影響，作者利用KEGG數(shù)據(jù)庫對16S rRNA序列進行了注釋。在比較海水和MP樣品時發(fā)現(xiàn)，MPs上與細(xì)胞運動、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)、外來生物降解和代謝相關(guān)的功能豐度顯著較高(p<0.05)。MPs和自然基質(zhì)之間的功能圖譜也有顯著差異。利用PVC作為具有代表性的基質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)與PVC相比，核苷酸代謝和轉(zhuǎn)錄的代謝通路在木材和貝殼上富集。當(dāng)比較生物膜中微生物的預(yù)測功能時，可以觀察到五種底物類型之間的微生物功能組成存在差異，盡管這些差異的幅度相對較低。以PE和PVC 為例，與復(fù)制和修復(fù)、遺傳信息處理、聚糖生物合成和代謝相關(guān)的通路在PE上富集，而與細(xì)胞運動、細(xì)胞生長和凋亡相關(guān)的通路在PVC 上富集。這些結(jié)果表明，MPs上微生物的代謝功能不同于周圍的水體和自然基質(zhì)。

圖5 海水和微塑料樣品中細(xì)菌群落(KEGG2級)的功能圖譜

7.不同基質(zhì)上塑料圈微生物群落的組合

通過計算β-NTI值來評估兩種類型的細(xì)菌群落組裝（確定性和隨機性）在不同基質(zhì)上的相對重要性。由于所有樣品的β-NTI值均在0.036~0.037之間，說明隨機性是影響所有測試樣品細(xì)菌群落組裝的主要因素。Venn圖顯示，超過一半的MP OTUs在海水中被觀察到，表明大量的MP附著的原核生物可能來自于周圍的水域。這些相似之處可能是由于MPs為某些傾向于在表面定居的原核生物成員提供了合適的生態(tài)位。不同聚合物類型的β-NTI值的差異可能反映了中性或非中性分布分區(qū)的遷移速率和分類組成。結(jié)合使用加權(quán)β-NTI和基于Bray-curtis的Raup-Crick(RCbray)來評估不同組裝過程的相對貢獻，并使用零模型分析來估計影響塑料圈群落組成的生態(tài)過程。對于MPs和自然基質(zhì)上的細(xì)菌群落，擴散限制是最重要的生態(tài)過程，并解釋了72.22–94.44%的群落更替。然而，在自由生活的微生物群落的數(shù)據(jù)集中，擴散限制、均勻化擴散和生態(tài)漂移分別占33.33%、28.79%和37.88%，表明各生態(tài)過程在推動海水樣本中細(xì)菌群落聚集方面發(fā)揮相同重要性的作用。

圖6 β-NTI在不同樣本中的分布(A)及微生物組裝過程中分散限制、均質(zhì)化擴散和不確定性過程的比例(B)

三、結(jié)論與亮點

本研究采用16S rRNA基因擴增子測序，研究了MPs上不同類型聚合物對細(xì)菌組裝圖譜的影響。有助于了解在塑料圈微生態(tài)系統(tǒng)中影響微生物結(jié)構(gòu)組裝的特定生態(tài)過程。為了更全面地了解塑料微生物的組裝機制和環(huán)境因素，分析其他參數(shù)，如水文特征、生態(tài)位類型、基質(zhì)特征和更長的研究時間，改變隨機性和確定性裝配過程之間的動態(tài)平衡是必要的。

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